Lietuvių tautinio judėjimo veikėjas ir ideologas, mokslininkas, gydytojas, Lietuvos Nepriklausomybės Akto (1918 m. vasario 16 d.) signataras. Gimė pasiturinčių valstiečių šeimoje. 1873 m. baigė Marijampolės gimnaziją, įstojo į Maskvos universitetą, mokėsi Istorijos ir filologijos, vėliau – Medicinos fakultete. Jau studijų metais domėjosi ir Lietuvos istorija bei archeologija, rinko lietuvių tautosaką. Siekė lietuvių spaudos draudimo panaikinimo, rūpinosi liaudies švietimu.

1879–1905 m. gyveno Bulgarijoje, dirbo gydytoju įvairiuose miestuose. 1882–1884 m. tobulinosi Prahoje. 1891 m. suteikta Bulgarijos pilietybė. Aktyviai dalyvavo Bulgarijos visuomenės, politiniame ir kultūros gyvenime, nuo 1894 m. aktyvus Bulgarijos demokratų partijos, įvairių mokslinių draugijų narys. Rinko bulgarų tautosaką bei etnografinę medžiagą.

Pirmuosius laisvės vilties spindulius J. Basanavičius pradėjo skleisti dar gyvendamas užsienyje. Nuo 1880 m. bendradarbiavo lietuvių periodinėje spaudoje, palaikė ryšius su Lietuvos visuomenės veikėjais bei rašytojais. 1883 m. parengė pirmuosius mėnraščio „Aušra“ numerius, iki 1886 m. buvo vienas pagrindinių jo bendradarbių – parašė apie 70 straipsnių, kuriuose propagavo lietuvių kalbą, tautosaką, istoriją, skatino lietuvių tautinės savimonės formavimąsi. J. Basanavičius aukštino Lietuvos praeitį, domėjosi lietuvių kalbos ištakomis, rinko lietuvių tautosaką ir skatino kitus ją rinkti, sukūrė savitą lietuvių kilmės teoriją.

Nuo 1905 m. iki mirties gyveno daugiausia Vilniuje. Dalyvavo ginant lietuvių tautos interesus ir atkuriant Lietuvos valstybingumą. Buvo Didžiojo Vilniaus seimo iniciatorius, vienas organizatorių ir pirmininkų. J. Basanavičiaus iniciatyva 1905 m. įkurta Tautiškoji lietuvių demokratų partija. Daug nuveikė gindamas lietuvių kalbą ir kultūrą nuo lenkinimo, lietuvių tikinčiųjų teises. Buvo vienas 1907 m. įsteigtos Sąjungos grąžinti teises lietuvių kalbai Romos katalikų bažnyčiose kūrėjų ir įstatų autorius. Lietuvių mokslo draugijos (įkurta 1907 m.) iniciatorius, steigėjas ir pirmininkas (iki mirties). Redagavo draugijos leidinį „Lietuvių tauta“. Dalyvavo daugelio kitų lietuvių draugijų bei organizacijų darbe. 1913 m. kartu su Valstybės tarybos nariu M. Yču išvyko į Ameriką rinkti aukų Lietuvių mokslo draugijos ir Dailės draugijos namams statyti.

Per Pirmąjį pasaulinį karą liko Vilniuje, dalyvavo lietuvių politinėje ir kultūrinėje veikloje. 1917 m. Lietuvių konferencijos, kurioje buvo išrinkta Lietuvos Taryba, pirmininkas. Tapo Tarybos nariu, pirmininkavo jos 1918 m. vasario 16 d. posėdžiui, priėmusiam Vasario 16 Aktą. Pasiliko ir lenkų valdomame Vilniuje. Saugojo Lietuvių mokslo draugijos turtą, su kitais gynė lietuvių teises.

Paskelbė mokslo studijų ir straipsnių istorijos, archeologijos, kultūros istorijos, etnografijos, folkloristikos, kalbotyros, sanitarijos klausimais. Daugiausia tyrė lietuvių etnogenezę ir kultūrą. Surinko ir paskelbė lietuvių tautosakos rinkinių.