Vienas iš lietuvių raštijos pradininkų, dvasininkas, kunigas.

1536 m. netoli Frydlando (vok. Friedland, dab. Pravdinsk) esančiame Bamblių (vok. Bammeln) kaime gimęs Bretkūnas buvo XVI a. dar tebegyvavusių tikrųjų etninių prūsų kilmės.

1555–1556 m. studijavo teologiją Karaliaučiaus universitete, nuo 1556 m. Wittenbergo universitete. 1562–1587 m. Labguvos klebonas (čia pirmasis sakė pamokslus lietuvių k.), vėliau kunigavo Karaliaučiaus lietuvių parapijoje.

Parengė ir 1589 m. išleido knygą, kurią sudaro „Giesmės duchaunos“ (76 giesmės, tarp jų 42 iš M. Mažvydo giesmyno), M. Mažvydo „Parafrazis“, „Kancionalas“ (17 giesmių su gaidomis iš M. Mažvydo giesmyno) ir „Kolektos“ (pirmoji išlikusi liet. maldaknygė).

1591 m. išleido pamokslų rinkinį „Postilė“ (2 d.). Pamoksluose atsispindi žmonių buitis, yra žinių apie senovės lietuvių tikėjimą, grožinės prozos elementų.

1579–1590 m. pirmasis į lietuvių kalbą išvertė visą Bibliją. Evangeliją pagal Luką vertė iš lotynų k., kitas dalis – iš vokiško M. Liuterio vertimo, be to, lygino su graikiškais, hebrajiškais tekstais. Vertimas nebuvo išleistas, dalį suredagavęs išleido J. Rėza („Psalteras Dovydo“, 1625). 1991 m. pradėtas faksimilinis vertimo leidimas (iki 1996 m. išleisti 3 t.). J. Bretkūno leidimu naudojosi 1735 m. Biblijos rengėjai, lietuvių kalbos tyrinėtojai (vertimas 2002 m. eksponuotas Vilniuje).

Išvertė „Augsburgo išpažinimą“, vokiečių teologų tekstų.